높은 수준의 대규모 생물학적 시료 준비

Nature Protocols 18권, 페이지 1441–1461(2023)이 기사 인용

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건강한 장기 형태와 병리생리학적 변화를 이해하려면 다양한 규모의 이미징이 필수적입니다. 손상되지 않은 인간 장기를 포함한 대형 샘플의 거시적 및 미시적 3차원 형태는 X선 현미경 단층촬영(실험실 또는 싱크로트론 소스 사용)을 통해 가능합니다. 그러나 고해상도 이미징을 위한 대형 샘플 준비는 샘플 수축, 불충분한 대비, 샘플 이동 및 장착 또는 스캐닝 중 기포 형성과 같은 제한 사항으로 인해 어렵습니다. 여기에서는 X선 미세 단층 촬영을 위한 대형 연조직 샘플의 준비, 안정화, 탈수 및 장착에 대해 설명합니다. 우리는 유럽 싱크로트론 방사선 시설에서 전체 인간 장기 및 계층적 위상차 단층 촬영에 적용되는 프로토콜을 자세히 설명하지만 완전한 유기체를 포함한 다양한 생물학적 샘플에 적용 가능합니다. 이 프로토콜은 X선 이미징을 사용할 때 대비를 향상시키는 동시에 샘플 방향이 다른 경우에도 스캔 중에 샘플의 움직임을 방지합니다. 장착 중에 갇힌 기포와 스캐닝 중에 형성된 기포(싱크로트론 X선 이미징의 경우)는 여러 탈기 단계를 통해 완화됩니다. 시료 준비는 자기공명영상, 컴퓨터 단층촬영 및 조직학적 관찰과도 호환됩니다. 인간의 뇌나 심장과 같은 큰 기관의 경우 샘플 준비 및 장착에 24~36일이 필요합니다. 준비 시간은 조직의 구성, 크기 및 취약성에 따라 다릅니다. 이 프로토콜을 사용하면 1μm의 로컬 복셀 크기로 직경 150mm의 온전한 장기를 스캔할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하려면 인간 또는 동물 장기 처리, 실험실 운영 및 X선 영상 처리에 대한 전문 지식을 갖춘 사용자가 필요합니다.

건강과 질병 모두에서 인간 장기 형태의 정량화는 차원 규모에 걸쳐 확장할 수 있는 다중 모드 공간 이미징 방식으로 처리할 수 있는 복잡한 작업입니다. 완전한 조직 형태학적 특성화에는 규모 간 상호 작용의 감지가 필요합니다. 그러나 대부분의 이미징 기술은 해상도나 시야에 의해 제한되므로 거시적인 관찰과 미세한 관찰 및 데이터를 연결하는 것이 어렵습니다. 기존의 조직학1,2,3 또는 전자 현미경4,5,6 접근법을 사용하면 연속 섹션을 통해 조직의 미세 구조 조직 및 구성을 시각화할 수 있으며 데이터를 적절하게 정량화할 수 있습니다. 그러나 이러한 접근법은 일반적으로 조직의 샘플링과 절편이 필요하며 극도로 노동 집약적이고 시간 소모적입니다. 광시트 현미경과 결합된 광학 클리어링은 고해상도로 넓은 시야를 제공할 수 있습니다. 그러나 조직 제거에는 많은 시간이 필요하며 종종 비용이 많이 듭니다. 또한, 광 시트 현미경의 이미징 깊이는 대물 렌즈 작동 거리에 의해 제한됩니다. 전체 성인 인간 장기8 또는 전체 동물9을 몇 달에 걸쳐 제거한 경우에도 영상화는 여전히 어렵습니다. 유사한 단점은 광간섭 단층촬영10,11, 다광자 현미경12 또는 공초점 현미경13,14에 적용되며, 이는 세포 규모에서 조직의 국소 3차원(3D) 미세 구조를 캡처할 수 있지만 조직 침투가 제한되어 심부 조직 이미징을 방해합니다. 최근 고해상도 자기공명영상(MRI)은 생체 외 인간 뇌 전체에서 100 μm의 등방성 복셀 크기를 달성했습니다. MRI는 비파괴적이고 시야가 넓지만 조직 미세 구조를 검사하기에는 해상도가 여전히 충분하지 않습니다. 계층적 이미징 기술은 해상도와 시야 사이의 균형을 극복할 수 있습니다. 계층적 접근 방식에서는 동일한 샘플의 여러 이미지를 서로 다른 해상도로 획득하여 서로 다른 규모를 연결합니다. 마이크로컴퓨터 단층촬영(μCT)은 150μm 복셀의 해상도로 전체 폐를 이미지화한 후 폐에서 생검 코어를 추출하는 데 사용되었습니다. 그런 다음 이러한 작은 코어를 μCT로 스캔하여 10μm 복셀을 달성했습니다.